熒光定量PCR就是實(shí)時檢測PCR每個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物相對的熒光信號，來實(shí)現(xiàn)對起始模板進(jìn)行定量及定性的分析。熒光定量PCR是通過多擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，并分析指數(shù)期的擴(kuò)增情況來實(shí)現(xiàn)對起始模板的定量分析。該技術(shù)使用的熒光來源包括熒光探針和熒光染料。前者是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，因此特異性更高；而后者則能結(jié)合所有的雙鏈DNA，因此不必因模板的不同而特別定制，通用性強(qiáng)，但需要保證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
 

　　下面為您介紹熒光定量PCR的顯色和比色分析：
 

　　顯色是elisa中的溫育反應(yīng)，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時間一般不需要嚴(yán)格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色狀況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。
 

　　比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。
 

　　比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔(未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔)，以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計算。
 

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