腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是腫瘤治療失敗的重要因素之一，成為目前阻礙腫瘤治療的絆腳石。因此，探索腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的原因以及如何改善腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥仍是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它的機(jī)制廣泛牽涉到藥物代謝學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)等多個(gè)學(xué)科，這就決定了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制是復(fù)雜的，因此體外建立化療藥物耐藥細(xì)胞株仍然是研究腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制的重要方法。

　　

　　一種藥物長(zhǎng)期作用于某類細(xì)胞，殺死其中沒(méi)有抗性的細(xì)胞，而對(duì)這類細(xì)胞中具有抗性的細(xì)胞不能殺死，即進(jìn)行了選擇。具有抗性的細(xì)胞大量繁殖產(chǎn)生很多抗性后代，但再用這種藥物時(shí)表現(xiàn)出的藥效大大下降的現(xiàn)象就是細(xì)胞的耐藥性，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)特定藥物產(chǎn)生耐藥性，從而構(gòu)建出對(duì)特定藥物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞株。

　　

　　耐藥細(xì)胞株構(gòu)建實(shí)驗(yàn)：

　　

　　原理：細(xì)胞與低劑量的藥物長(zhǎng)期接觸，引起細(xì)胞本身藥物化學(xué)過(guò)程的改變，細(xì)胞膜上出現(xiàn)Pgp糖蛋白，使細(xì)胞逐漸對(duì)藥物耐受，隨著藥物濃度的遞增，其耐受程度逐漸加強(qiáng)。

　　

　　實(shí)驗(yàn)材料及試劑

　　

　　培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、移液槍等；血清培養(yǎng)液、PBS、相應(yīng)作用的藥物等。

　　

　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

　　

　　大劑量間隙作用：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞置于含有濃度的藥物濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后更換不含藥物的RPMI-1640（DMEM）胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，傳代兩次，再將篩選出的細(xì)胞在濃度的藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)依這樣不斷改變作用時(shí)間，共經(jīng)過(guò)1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個(gè)作用時(shí)間段，約8個(gè)月的培養(yǎng)，終使得細(xì)胞能夠在一定濃度的藥物的培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個(gè)月在檢測(cè)細(xì)胞的生物特性及耐藥指標(biāo)。

　　

　　濃度梯度遞增間隙作用：采用藥物濃度遞增培養(yǎng)法沖擊誘導(dǎo)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞處于60～70%濃度對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)時(shí)，加入起始濃度為低濃度的藥物作用24h，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后，消化傳代復(fù)以低濃度作用細(xì)胞24h，待細(xì)胞增殖至正常形態(tài)后，重復(fù)上述藥物沖擊，每種濃度沖擊8次。待細(xì)胞在此濃度穩(wěn)定生長(zhǎng)后，提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)，藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導(dǎo)歷時(shí)大約9個(gè)月，直到細(xì)胞能夠在濃度的藥物中穩(wěn)定生長(zhǎng)。